重磅研究揭示新冠病毒演变：突变如何显著增强传染力

目前与新冠病毒最紧密相关的病毒株为β型冠状病毒RaTG13，RaTG13此前从中华菊头蝠中分离出。研究团队使用核苷酸序列对特定病毒蛋白（例如orf1a，S蛋白，基质和核衣壳）进行了其他系统发育分析后发现，RaTG13病毒株与其他蝙蝠类SARS样冠状病毒株同样有密切关系。

研究人员进一步估计，大多数2019-nCoV和RaTG13病毒蛋白之间的差异发生在2005年至2012年之间，而人类SARS病毒和蝙蝠SARS样冠状病毒之间的差异发生在1990至2002年之间。

研究人员在讨论环节总结道到，“我们的进化时钟分析估计，2019-nCoV分别于大约12年前和30年前从RaTG13和人类SARS-CoV中分化出来。”而除了点突变外，还有潜在的证据表明重组也是2019-nCoV进化的机制。

在比较全长S蛋白序列时，研究人员发现，2019-nCoV与人和蝙蝠SARS病毒的序列同源性为39％，与MERS或其他冠状病毒的同源性则为29％。

值得注意的是，研究团队发现2019-nCoV和穿山甲冠状病毒在S蛋白的RBD（氨基酸315-550区域）中共享几乎相同的氨基酸序列，但与RaTG13却不相同。

穿山甲CoV（蓝线）和RaTG13 / 2013（绿线）与2019-nCoV的氨基酸同源性对比图，保守受体结合结构域（RBD）以黄色突出显示

为了证实这一发现，研究团队将此前别的课题组发表的穿山甲CoV与先前分离但未发表的穿山甲CoV序列进行了比较。

基于比对和系统发育分析，研究人员发现2019-nCoV的共有序列与BetaCoV / 穿山甲/广东/P2S/2019（EPI_ISL_410544）具有最高的同一性，而在广西分离的穿山甲CoV株则发现存在其他突变和插入缺失。

接下来，研究人员使用ML方法（Maximum likelihood，最大似然法）检测了2019-nCoV的共有S蛋白序列与25种代表性CoV病毒株（包括Hu-CoV，SARS和MERS）和5新穿山甲CoV病毒株的系统发育关系。

结果表明，2019-nCoV的S蛋白可能从穿山甲冠状病毒衍生出来，而不是蝙蝠冠状病毒RaTG13，当然这两者都可能与蝙蝠-SARS-CoV或bat-SL-CoVZC542处于同一谱系。

他们提出，2019-nCoV的整个基因组结构与RaTG13最具有同源性，但S蛋白的RBD却与穿山甲CoV最具同源性，这一差异表明在2019- nCoV 的进化过程中，RaTG13样冠状病毒和穿山甲样冠状病毒病毒株之间可能发生了重组。

研究人员还进一步检查了基因组中的所有氨基酸突变。他们发现，当比较穿山甲样冠状病毒和2019-nCoV时，除了RBD外，nsp（非结构蛋白）14和15中的区域还共享连续序列（图3D）。

两个进化枝，以及独特的弗林蛋白酶切位点

为了进一步评估2019-nCoV与其他SARS冠状病毒的关系，研究人员分析了2019-nCoV和不同的人/蝙蝠SARS病毒的RBM（Receptor binding motif，受体结合基序），并观察到它们可以清楚地分为两个不同的进化枝。

进化枝I病毒包括2019-nCoV、穿山甲CoV，以及12种蝙蝠SARS（蝙蝠SARS CoV I，例如RaTG13）和人类SARS病毒。

进化枝II病毒则包含了49种蝙蝠SARS病毒（bat SARS CoV II），例如ZXC21和ZC45，它们与2019-nCoV有大约90％的核苷酸和氨基酸同源性性。 

上述两个进化枝之间的主要区别在于，进化枝II病毒的RBM存在5个、13-14个比进化枝I病毒短的氨基酸区域。

此前的研究表明，SARS病毒RBM的13-14个氨基酸区域形成独特的环结构，该结构通过两个半胱氨酸残基之间的二硫键稳定。尽管该环区中2019-nCoV的氨基酸序列与人SARS病毒的氨基酸序列非常不同，但两个半胱氨酸残基都是保守的。

有趣的是，所有已知使用ACE2作为进入受体的病毒都属于I型，而所有不使用ACE2进入受体的蝙蝠SARS病毒都属于II型。因此，研究团队预测，包括2019-nCoV在内的I型分支病毒可以通过人ACE2（血管紧张素转换酶2）感染宿主细胞，而II型分支病毒不能通过ACE2感染宿主细胞。

此前的研究得出的是，SARS病毒使用人ACE2作为受体来感染宿主细胞，而MERS病毒则是使用DPP4作为其受体。最近的一些表明ACE2也是2019-nCoV的进入受体，尽管其他宿主细胞因子如TMPRSS2也可能参与其中。

在进化枝II病毒中，尽管它们的总体基因组序列与2019-nCoV存在同源性，但尚无属于该枝的病毒利用ACE2进入受体的报道。

因此，这一研究不仅强调了RBM在确定进入受体特异性中的关键作用，而且提出了一个有趣的问题，即β冠状病毒的同源病毒株如何通过RBM中的插入、缺失或重组等突变来改变趋向性。

值得注意的是，研究团队还发现，2019-nCoV在S蛋白内或核苷酸位置23619-23632上有独特的四个氨基酸插入（681-PRRA-684）。

有趣的是，上述2019-nCoV的S蛋白中的这种插入（PRRA）为哺乳动物弗林蛋白酶蛋白创建了潜在的切割位点RRAR。

为了了解这种插入的独特性，研究团队使用了来自人、麝猫和蝙蝠的SARS-CoV株进行了序列比较。他们发现，这种插入是2019-nCoV特有的。当与其他冠状病毒家族成员进行比较时，研究人员发现也能够识别到类似的位于S蛋白的S1和S2域之间结构边界的插入。

而此前的研究则表明，病毒可能发生蛋白酶裂解，从而触发病毒-细胞膜之间的融合。这种启动和触发融合机制的灵活性极大地调节了不同冠状病毒的致病性和趋向性。

不过，此前在SARS-CoV中没有检测到这种蛋白酶裂解。在SARS-CoV中引入一个酶切位点，则会导致S蛋白的裂解并增强膜融合活性。此外，在SARS-CoV假型病毒中引入一个裂解的S蛋白，也会使其能够直接进入宿主细胞。

根据之前的测序和结构分析，2019-nCoV S蛋白被预测为可以与ACE2受体相互作用，触发与宿主细胞膜的融合并引发感染。因此，导致S1-S2亚基改变的突变或插入会显著影响病毒感染。

研究团队推测，PRRA的插入可能使S蛋白裂解，从而触发病毒融合事件。

（编辑：52刷机网）

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